Las pruebas bioquímicas permiten determinar las características metabólicas de las bacterias objeto de identificación.
Algunas de estas pruebas son técnicas rápidas, ya
que evalúan la presencia de una enzima preformada y su lectura varía entre unos
segundos hasta unas pocas horas. Otras pruebas requieren para su lectura el
crecimiento del microorganismo con una incubación previa de 18 a 48h; a este
grupo pertenecen la mayoría de las pruebas que detectan componentes metabólicos
o aquellas que determinan la sensibilidad de un microorganismo a una sustancia
dada tras cultivo en medios de identificación que contienen el sustrato a
metabolizar.
La forma usual de detectar una enzima se basa en el
principio de que si está presente, utilizara un sustrato determinado que ha
sido puesto adrede en el medio de cultivo o en una prueba bioquímica
determinada. Los productos terminales de la acción enzimática son detectados a
través de indicadores de PH o por el aparecimiento de pigmentos que hacen virar
el color del medio.
Funciones de los componentes básicos de los medios de cultivos:
·
Sustrato: Reacciona con la enzima específica y
da origen a productos terminales que pueden ser ácidos o alcalinos.
·
Indicador de PH: Detecta productos terminales de
la utilización del sustrato. Son colorantes añadidos para indicar los cambios
que hay en el medio durante el crecimiento de los microorganismos. Estos
indicadores son sensibles a los cambios de PH, por lo tanto, los virajes de
color de los mismos indican de manera indirecta la presencia de productos
terminales del empleo e sustrato.
·
Nutrientes: La mayoría de las bacterias no
crecerán solo con la presencia del sustrato básico, por lo que se requiere
agregar diversos nutrientes que varían, dependiendo de los requerimientos de
cada bacteria.
·
Inhibidores: Son utilizados más en medios selectivos
iníciales, pero hay que tener en cuenta que no todos los microorganismos
deseados serán inhibidos y no todos los deseados crecerán.
Fermentación de la lactosa en Agar McConkey
Fundamento: Es un medio selectivo diferencial que
permite determinar si las bacterias Gramnegativas fermenta o no la lactosa. Las
sales biliares y el cristal violeta
inhiben el crecimiento de los Grampositivos. Las colonias de bacterias que
fermentan la lactosa son rosadas y pueden estar rodeadas de una zona de
precipitados de sales biliares, el cual es debido a una caída en el pH por la
fermentación de la lactosa. Las colonias que no fermentan la lactosa permanecen
incoloras.
Lectura e interpretación: Las bacterias
fermentadoras de lactosas se observan de color rosado con o sin zona de
precipitado alrededor, mientras que las no fermentadoras de lactosa se observan
incoloras o transparentes
TSI:
Agar Tres Azúcares o Triple Azúcares y Hierro.
Fundamento: Este medio se
utiliza para determinar la capacidad de los bacilos gramnegativos para
fermentar lactosa, sacarosa y glucosa, así como para determinar su capacidad de
producir H2S (ácido sulfúrico) y gas.
El tubo contiene dos cámaras
de reacción, en la parte inclinada (pico de flauta) se fermenta la lactosa y la
sacarosa y en la parte profunda se fermenta la glucosa. Se puede fermentar los
tres azucares o uno de ellos lo cual dependerá del microorganismo que se
estudie.
Lectura e interpretación:
·
Kalium-kalium K/K: Se observa tubo color rojo, no
fermenta ninguno de los azúcares.
·
Acido-Acido A/A: Se observa todo el tubo de color
amarillo, fermenta la glucosa, lactosa y sacarosa, con producción o no de gas,
la cual se representa con (G) si es abundante y (g) si es poca.
·
Kalium-Acido K/A: Se observa el tubo en la
parte inclinada color rojo y amarillo el fondo, fermenta solo la glucosa, con
producción o no de gas, la cual se representa con (G) si es abundante y (g) si es poca.
· Kalium- Acido K/A+: Se observa el tubo parte inclinada rojo y amarillo el
fondo, con enecrecimiento, fermenta la glucosa, con producción de H2S
la cual se representa por (+), con producción o no de gas, la cual se
representa con (G) si es abundante y (g)
si es poca.
LIA:
Lisina Hierro Agar.
Fundamento: Es un medio para
detectar enzimas que descarboxilan o desaminan la lisina en bacilos
gramnegativos. Adicionalmente detecta enzimas que producen sulfuro de hidrógeno
y gas proveniente de la glucosa.
No existen Enterobacterias que posean las dos
enzimas (descarboxilasa y desaminasa de la lisina) por lo que sólo se tiene que
observar, o una de ambas reacciones o la ausencia de ambas.
Lectura e interpretación:
·
Kalium- Kalium K/K: Se observa tubo color violeta, descarboxilación de la lisina con
producción o no de gas, la cual se representa con (G) si es abundante y (g) si
es poca. Se interpreta Lisina Positiva.
·
Rojo-Acido R/A: Se observa
tubo color rojo superficie y amarillo fondo, desaminación de la lisina, con
producción o no de gas, la cual se representa con (G) si es abundante y (g) si
es poca. Se interpreta Lisina
desaminasa.
·
Kalium-Kalium K/K+: Se observa tubo color violeta superficie y negro fondo,
descarboxilación de lisina, con producción de H2S la cual se representa por
(+), con producción o no de gas, la cual se representa con (G) si es abundante
y (g) si es poca.
·
Kalium-Acido K/A: Se observa
tubo color violeta en la superficie y amarillo en el fondo, el color amarillo se
debe a la fermentación de glucosa. Puede haber o no producción de gas. Se interpreta Lisina negativa. Quiere decir
que no descarboxilo ni desamino la lisina.
Nota:
Es
importante diferenciar las diferentes reacciones del tubo de LIA, conocer
cuando el microorganismo es lisina positiva, lisina negativa y lisina
desaminasa. Las cuales serán de mucha utilidad junto con la fermentación de
lactosa en el plato de MacConkey para realizar montaje del resto de bioquímica
de identificación.
MIO:Movilidad, Indol,
Ornitina.
Fundamento: Es un medio que se utiliza para determinar la presencia de
flagelos, así como las enzimas descarboxilasa de ornitina y triptofanasa. Por
lo tanto, sirve para determinar la movilidad, descarboxilación de la ornitina y
producción de indol.
Algunas bacterias poseen flagelos y otras carecen de ellos. Este medio
ayuda a diferenciar las móviles de las no móviles.
Lectura e
interpretación: La movilidad se observa por turbidez del medio, si sólo
se observa crecimiento en la estría realizada es negativa. Si la bacteria posee
la enzima triptofanasa, al agregar el reactivo (3 gotas) de Kovac
(p-dimetilaminobenzaldehido) o Erlich se observa un anillo color rosado
intenso. La presencia de enzima decarboxilasa de Ornitina, desdobla la Ornitina a putrescina, lo
que intensifica el color violeta del medio fondo del tubo. Un viraje del
violeta al amarillo se interpreta ornitina negativo.
Urea deCrhistensen:
Fundamento: Detecta la presencia de la enzima ureasa. Cuando la bacteria
tiene la enzima, la urea es desdoblada a amonio y CO2. El amonio
alcaliniza el medio haciendo virar el indicador al rosado intenso.
Lectura e interpretación: Una color rosado intenso indica reacción
positiva, si el medio conserva su color original de amarillo pálido o un poco
más intenso indica reacción negativa.
Citrato
de Simons:
Fundamento: Determina la capacidad de un microorganismo de utilizar el
citrato como única fuente de carbono.
Lectura e interpretación: Un viraje de color verde al azul marino
y crecimiento en la superficie da una reacción positiva, de lo contrario es
negativa
Malonato
(caldo malonato fenilalanina):
Fundamento: Evalúa la capacidad del microorganismo de utilizar el malonato
como única fuente de carbono y la
desaminación de la fenilalanina, en forma combinada.Las Enterobacterias no
tienen la capacidad enzimática de realizar las dos reacciones simultáneamente,
por lo que, o se observa la utilización del malonato o la desaminación de la
lisina.
Lectura e
interpretación: Un viraje de color verde al azul, da una reacción
positiva, de lo contrario es negativa.
Rojo de Metilo (RM) - VoguesProskauer
(VP):
Fundamento:
VP: Capacidad de un microorganismo de producir un producto final
neutro, el acetilmetilcarbinol (acetoína), a partir de la fermentación de la
glucosa.
RM: Comprobar la capacidad de un microorganismo de producir y mantener
estables productos terminales ácidos de la fermentación de la glucosa.
Lectura e interpretación:
El RM es
positivo si se observa un anillo de color rojo en la superficie del medio al
agregar 2gts de reactivo rojo de metilo.
El VP es positivo si se observa un anillo de color
zapote intenso en la superficie del medio. Al agregar 4gts de KOH al 40% y 6gts
de alfa naftol.
Excelente
ResponderEliminarMUY buen trabajo.
ResponderEliminarBuen trabajo
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ResponderEliminarMe parece que este escrito esta muy completo, los fundamentos de las pruebas bioquímicas están redactadas de una forma muy comprensible y además las interpretaciones son muy claras y prácticas.
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